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Intro ......

 

37℃ 에서 O. (5)Precipitation : Neutralized 10% PEI(polyethyleneimine)을 최종 0. (3) Cell lysis : pellet에 10ml의 Buffer A와 final conc. Theory 5. Title 2.. (2) Induction : IPTG를 final concentration 0. -이과정까지는, supernatant 제거한다.hwp 자료문서 (열기). (6)lWashing : Buffer C25 (25mM KCl) 3ml로 pellet을 washing한 후 12,, 조교님께서,000 rpm/15 min/4 ℃ 에서 centrifugation후 sup. (1M IPTG 100ul 첨가) 3rd day (1) Harvest : culture를 각각 500ml centrifugation tube로 옮긴 뒤 high speed centrifuge로 6,000 rpm/10 min/4℃ 에서 centrifugation 한 후 media를 제거한다. [실험] Purification of Thermostable DNA Polymerase.D.를 제거한다.hwp [실험] Purification of Thermostable DNA Polymerase.15%가 되도록 한 방울씩 천천히 첨가(330ul)하면서 sample을 잘 섞어준 후 얼음 위에서 10분간 incubation한 뒤, step 4와 동일한 조건으로 centrifugation하고 sup. 실험과정 및  ......

 

 

Index & Contents

실험 자료 Purification of Thermostable DNA Polymerase Down

 

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[목차]

 

1. Title

2. Date

3. 실험자

4. Theory

5. 실험과정 및 준비물

6.Result

7. Discussion

8. Further study

 

 

 

1st day

(1)Seed Culture : 3ml LA media(LB + ampicillin)에 single colony를 접종한 후 37℃ 에서 overnight culture한다.

 

2nd day

(1) 200ml LA media에 seed culture 2ml을 inoculation하여, 37℃ 에서 O.D.600nm ~0.5가 될 때까지 진탕배양 한다.

(2) Induction : IPTG를 final concentration 0.5mM이 되도록 첨가한 뒤, 14~16시간 동안 37℃ 에서 진탕배양 한다. (1M IPTG 100ul 첨가)

 

3rd day

(1) Harvest : culture를 각각 500ml centrifugation tube로 옮긴 뒤 high speed centrifuge로 6,000 rpm/10 min/4℃ 에서 centrifugation 한 후 media를 제거한다.

(2)20ml Buffer A로 pellet을 resuspension한 후 위와 동일한 조건에서 centrifugation 하고, supernatant 제거한다.

-이과정까지는, 조교님께서, 미리 실험 해 놓음.

(3) Cell lysis : pellet에 10ml의 Buffer A와 final conc. 4mg/ml로 lysozyme을 넣고 resuspend한 후, R/T에서 15분 동안 incubation한다. (Rotator 이용)

 

(4) Buffer B를 10ml 첨가한 뒤 75 ℃ 에서 10분 간격으로 sample을 잘 섞어주며 1시간 동안 incubation하고, high speed centrifuge로 12,000 rpm/20 min/4 ℃ 에서 centrifugation한 후 새 tube에 supernatant를 조심스럽게 옮긴다.

(5)Precipitation : Neutralized 10% PEI(polyethyleneimine)을 최종 0.15%가 되도록 한 방울씩 천천히 첨가(330ul)하면서 sample을 잘 섞어준 후 얼음 위에서 10분간 incubation한 뒤, step 4와 동일한 조건으로 centrifugation하고 sup.를 제거한다.

(6)lWashing : Buffer C25 (25mM KCl) 3ml로 pellet을 washing한 후 12,000 rpm/15 min/4 ℃ 에서 centrifugation후 sup.를 제거한다. (Option : 1번 반복)

<- 이번 실험에서는 이 과정을 생략시킴.

 

 

 

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